Počkejte prosím chvíli...
Nepřihlášený uživatel
iduzel: 18452
idvazba: 22817
šablona: stranka
čas: 22.9.2017 06:14:14
verze: 3813
uzivatel:
remoteAPIs:
branch: trunk
Obnovit | RAW

Hana Stryjová

Identification and quantification of technologically important bacteria in activated sludge samples

Identifikace a kvantifikace technologicky významných skupin bakterií v aktivovaném kalu

Vedoucí/Supervisor

Prof. Ing. Jiří Wanner, DrSc.

Jazyk/Language

Czech

Abstrakt

Prvním cílem této práce je sumarizace nejnovějších poznatků vědy v oblasti nejčastěji používaných molekulárně biologických metod v čištění odpadních vod, konkrétně metody fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a polymerázové řetězové reakce s následnou denaturační gradientovou gelovou elektroforézou (PCR-DGGE). Součástí je také zmínka o úskalích těchto metod a jejich možných řešeních. Tato kapitola je zahrnuta v teoretické části práce společně s částí týkající se odstraňování dusíku z odpadních vod, pozornost je věnována zejména nitrifikaci.

Experimentální část je rozdělena do dvou kapitol. První z nich se zabývá analýzou mikrobiálního složení suspenzní biomasy aktivovaných kalů pěti městských biologických čistíren odpadních vod (ČOV) se zaměřením na detekci přítomných nitrifikačních populací FISH analýzou. Vzorky byly hodnoceny digitální obrazovou analýzou pořízených snímků, množství nitritačních bakterií, vyjádřené jako všechny Betaproteobacteria oxidující amoniakální dusík, bylo zároveň vizuálně kvantifikováno v mikroskopu využitím objektivu s implementovanou mřížkou. Pro posouzení vlivu ročních dob a teploty byly hodnoceny vzorky ze září a z února. Součástí práce bylo dále kinetické měření odebraných kalů pomocí laboratorních testů s následným výpočtem specifické aktivity nitrifikační biomasy a hodnocení složení a změn v charakteru biomasy mikroskopickým rozborem. Z naměřených výsledků vyplývá, že množství nitritačních bakterií (AOB) v aktivovaných kalech se v zimním období zvýšilo ve dvou případech z pěti sledovaných ČOV, na dvou ČOV došlo k poklesu množství a na jedné ČOV byla četnost těchto bakterií srovnatelná. Přímá mikroskopická kvantifikace potvrdila pokles množství AOB v zimním období pouze v jednom případě z pěti. Halofilní a halotolerantní druhy Nitrosomonas nebyly v žádném vzorku významněji zastoupeny. V zimním období byla ve všech sledovaných kalech zvýšená četnost bakterie Nitrosomonas oligotropha. Aktivita AOB byla ve třech případech v zimním období nižší, na jedné ČOV srovnatelná a na jedné ČOV mírně vyšší. Aktivita byla zachována v kalech, ve kterých došlo k poklesu množství AOB, na těchto čistírnách bylo zároveň v zimě stanoveno největší množství nitratačních bakterií (NOB). Přítomnost bakterií rodu Nitrobacter a zástupců Candidatus Nitrotoga arctica nebyla v žádném vzorku pozorována.

Druhá část práce se zabývá porovnáním účinnosti čtyř komerčně dodávaných kitů určených k izolaci celkové genomické DNA ze čtyř vzorků bakteriálních směsných kultur imobilizovaných v polyvinylalkoholových peletách (biokatalyzátor LentiKat´s) a dvou vzorků aktivovaných kalů městských biologických ČOV. Kity byly hodnoceny dle výtěžnosti, čistoty extraktu, produkce odpadu během izolace, doby extrakce, ceny analýzy, úspěšnosti amplifikace PCR a fylogenetické diverzity vzorku. Extrakty PowerSoil® DNA Isolation kitu byly v případě všech vzorků nejčistší, ovšem výtěžnost DNA byla poměrně nízká. Druhý nejlepší v čistotě vyextrahované DNA byl MasterPureTM DNA Purification Kit, který také dosáhl nejlepších výsledků z hlediska ceny a produkce odpadu. Fylogenetické zasoupení druhů v extraktech jednotlivých kitů se příliš nelišilo.

Abstract

The first goal of the thesis is to summarize current knowledge on some of the most popular molecular biology methods used in wastewater treatment, fluorescent in situ hybridization (FISH) and polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE). Problems and solutions relating to these methods are also mentioned and are included in theoretical part of the presented work together with nitrogen cycle processes where particular attention is paid to nitrification because of its key role in efficient nitrogen removal process.

The experimental part of this thesis is divided into two chapters. The first part is focused on microbial analysis of nitrifying bacteria in activated sludge samples from five Czech sewage wastewater treatment plants (WWTPs). FISH analysis is used for identification and quantification of bacteria. Samples were collected twice a year for subsequent evaluation of the effect of season and temperature. The present study also investigated nitrification kinetics and microscopic evaluation of all activated sludge samples. According to the results, the number of ammonia oxidizing bacteria (AOB) during winter was higher in two of the five WWTPs investigated. At one WWTP the amount of AOB in winter was comparable to summertime levels and at the remaining two WWTPs levels were lower than in summer. Halophilic and halotolerant Nitrosomonas were not significantly present in any sample. In winter all samples contained a higher amount of the bacteria Nitrosomonas oligotropha. Activity analysis revealed that three WWTPs had more active bacteria in winter than in summer. One WWTP had comparable activity levels in winter, compared to summer, and at one plant the activity was inhibited. The presence of bacteria Nitrobacter and Candidatus Nitrotoga arctica was not observed using FISH analysis.

The objective of the second experimental part of this thesis was to compare the effectiveness of four commercial DNA isolation kits to isolate bacterial DNA from polyvinyl alcohol (PVA) biocarriers (Lentikat’s Biocatalysts) for use in downstream PCR based applications. There is a lack of information about species inoculated from wastewater and growing in this kind of biocarrier. The primary criteria for comparison were DNA yield, purity, waste generation, processing time, cost per sample, successful PCR amplification, and phylogenetic richness in extracts. In order to examine the effect of PVA on the extraction and purification processes activated sludge samples were also analyzed. The PowerSoil® kit performed the best in terms of purity across the board and is therefore recommended for applications requiring high purity but not necessarily high DNA concentration. The MasterPure™ kit performed the best in terms of cost and waste generation, the worst in terms of processing time, and second best in terms of purity. DGGE results demonstrated very low extraction bias between kits.

Aktualizováno: 11.6.2015 11:31, Autor: Lucie Pokorná

VŠCHT Praha
Technická 5
166 28 Praha 6 – Dejvice
IČO: 60461373
DIČ: CZ60461373

Datová schránka: sp4j9ch

Copyright VŠCHT Praha 2014
Za informace odpovídá Oddělení komunikace, technický správce Výpočetní centrum
zobrazit plnou verzi