Dana Vejmelková

Vedoucí/Supervisor

Prof. Ing. Jiří Wanner, DrSc.

Jazyk/Language

Czech

Abstrakt

Tato práce pojednává o různých způsobech identifikace mikroorganismů aktivovaných kalů, zejména nitrifikačních bakterií, jež jsou důležitou součástí při odstraňování dusíkatého znečištění z odpadních vod. V současné době jsou v popředí zájmu metody nezávislé na kultivaci, jako je například fluorescenční in situ hybridizace (FISH) nebo polymerázová řetězová reakce (PCR). Tyto dvě metody jsou stěžejní součástí této práce, nicméně kultivační techniky nejsou opomíjeny. Naopak je vyzdvihnuta jejich nepostradatelnost, a to především při identifikaci doposud nepopsaných mikroorganismů životního prostředí.

Pro rychlý povrchní screening vzorku postačí jedna metoda, např. FISH, avšak pokud je požadována podrobnější analýza mikrobiální populace, je většinou potřeba kombinovat více metod. Žádná z uvedených metod není „ideální“, všechny mohou někdy poskytovat nedostatečné informace, proto je vhodné porovnávat výsledky různých metod, případně upravit zavedené protokoly či navrhnout vlastní postupy. Různé identifikační techniky byly v této práci použity na vzorky aktivovaných kalů z laboratorních nitrifikačních reaktorů, z nichž některé byly provozovány za extrémních podmínek, vysoké koncentrace amoniakálního dusíku, dusitanů, či solí. Prvním provozovaným reaktorem byl desetilitrový chemostat, ve kterém byla díky nízké době zdržení pouze polovina z 6000 mg amoniakálního dusíku oxidována přes dusitany na dusičnany, čímž vznikal dusičnan amonný. Vzniklý produkt lze použít v zemědělství jako hnojivo, dochází tedy k znovuvyužití dusíku z odpadní vody. Vzhledem k tomu, že se zpočátku v tomto reaktoru nepodařilo identifikovat organismus zodpovědný za oxidaci dusitanů na dusičnany, byly postupně provozovány další reaktory, např. pro obohacení nitratační populace, které měly za cíl usnadnit jejich identifikaci.

Po kombinaci nejrůznějších metod, molekulárně-biologických i kultivačních, úspěšném i neúspěšném provozu reaktorů za různých provozních podmínek, spolupráci a diskusi s odborníky na dané téma, bylo dosaženo identifikace neznámého organismu. Byla identifikována nová nitratační bakterie, Nitrolancetus hollandicus. Největším překvapením tohoto objevu byla náležitost této bakterie do kmene Chloroflexi, neboť dosud popsané nitrifikační bakterie patří buď do kmene Proteobacteria nebo Nitrospirae. Pozornost byla také věnována důkladné analýze nitritační populace ve vybraných reaktorech. Za daných podmínek dominovaly reaktorům zástupci halofilních a halotolerantních Nitrosomonas spp., jež tvořily velmi kompaktní klastry.

Abstract

This work deals with an identification of bacteria playing role in nitrifying process of wastewater treatment by culture-independent methods but also showing how important cultivation is. It is always important to think what is supposed to be found in a sample and which technique suits its expectation the best. Mostly it is convenient to use a combination of different techniques. It cannot be said one technique is better than the other one. It always depends on a character of a sample and aims of analyses.

Using of a combination of cultivation and some of molecular-biological methods new bacterium was found during this work. This bacterium is a nitrite oxidizer and falls into the phylum Chloroflexi which was the biggest surprise of this finding. It is the first nitrifying bacterium belonging to other phylum than Proteobacteria or Nitrospirae. The new NOB was named Nitrolancetus hollandicus and it was first observed in a laboratory-scale bioreactor performing partial nitrification at high nitrogen load. This reactor was fed with a solution containing 6000 mg-N/L ammonium bicarbonate which was partially (about 50 %) converted into nitrate, producing ammonium nitrate solution. The final product could be used as a fertilizer which enables recovery of nitrogen from wastewater, in this case from sludge liquor.

However the identification of the new bacteria was not successful during an operating of this reactor so other bioreactors for enhancing unknown bacteria were running. Fluorescence in situ hybridization with various oligonucleotide probes and polymerase chain reaction in combination with denaturing gradient gel electrophoresis were applied. Nevertheless the gain of a pure culture of this new bacterium was crucial in its revelation and characterization. Next to identification and description of new nitrite-oxidizing bacterium ammonia-oxidizers were studied in detail in some of the reactors. Members of most halophilic and halotolerant Nitrosomonas spp. were dominating under given conditions in the examined reactors.